Лучше один раз увидеть, чем сто раз услышать.
В Колорадо глубокая ночь. Весна. В лаборатории мертвая тишина. Я в миллионный раз за последние полтора года повторяю одну и ту же процедуру. Искупав сотни крошечных белых эмбрионов дрозофилы в только что приготовленном растворе антител, я начинаю нервничать. Руководитель лаборатории Мэтью Скотт еще не в курсе, но я-то знаю, что это наша последняя попытка. Я больше не могу придумать, как выполнить этот эксперимент. У меня больше нет в запасе никаких трюков, и если и на сей раз ничего не получится, значит, мы напрасно трудились полтора года. Эмбрионы на стекле напоминают зернышки риса. Я направляю на них луч голубоватого света. Великий боже! Чудесные малютки "окольцованы" зелеными полосками! Нужно звонить шефу и бежать за выпивкой. Работа продолжается.
Вернуть цыпленка
Я рассказал о наборе генов, необходимых для развития, и о том, что открытию этого набора помогло исследование удивительных мутантов с аномальным количеством частей тела, их отсутствием или неправильным расположением. К счастью, в большинстве случаев природа все делает правильно и мухи и дети рождаются с нужным количеством частей тела в нужных местах. Но как это происходит? Каким образом эти удивительные гены превращают простую яйцеклетку в сложное животное?
Так называемый редукционистский подход в биологии заключается в изучении процессов жизнедеятельности на молекулярном уровне, для чего приходится "редуцировать" процессы и структуры до их молекулярных компонентов. Этот подход в последние пятьдесят лет использовался чрезвычайно успешно и позволил установить механизмы наследования, выявить причины многих заболеваний и создать новую медицинскую и диагностическую индустрию. Недостаток редукционистского подхода заключается в том, что многие биологические системы, такие как клетки, отдельные особи, популяции и сообщества, организованы на надмолекулярном уровне, так что знание составляющих их молекул не объясняет всех свойств этих систем. Точно так же, как знание того, что компьютер сделан из полупроводников, сверхпроводников и полимеров, не дает представления о том, как он устроен и работает, знакомство с генетическим набором инструментов не позволяет полностью воссоздать картину развития живого организма.
Эта ситуация напоминает ранний период эмбриологических исследований, когда эмбриологи изолировали с помощью "грубой силы" определенные популяции клеток, пытаясь понять, как они складываются в ткани и органы в процессе развития. Однажды Пол Вейс[5] проиллюстрировал знакомым эмбриологам однобокость редукционистского подхода. Он показал им фотографию целого куриного эмбриона, затем фотографию эмбриона, обработанного блендером, и, наконец, фотографию эмбриона, чьи перемолотые компоненты были собраны в одно целое путем центрифугирования. Вейс предельно четко обозначил проблему редукционизма: как собрать цыпленка обратно?
Набор генов развития — это лишь часть генетического багажа, небольшая доля из 13 700 генов у дрозофилы или 25 000 генов у млекопитающих. Действительно, мы нашли очень важные для сборки организма элементы, но как собрать из них цыпленка? Или хотя бы муху? Представьте себе, что вы купили новую игру или прибор, а в коробке обнаружили только пакетики с разрозненными деталями и инструкцию, состоящую из двух слов: "требуется сборка". В предыдущей главе я рассказывал о том, как благодаря анализу мутантных животных биологи смогли обнаружить ключевые гены развития. В этой главе мы пойдем в обратном направлении и попытаемся найти путь от генов к целым животным.
"Прозреть" нам с вами помогут карты. В книге "Карта следующего тысячелетия: Открытие новой географии" (Mapping the Next Millenium: The Discovery of New Geographies) писатель Стивен С. Холл говорит о том, что составление карт — один из первых этапов любого научного исследования. Все естествоиспытатели и ученые, начиная от великих путешественников пятнадцатого и шестнадцатого столетий и заканчивая современными астрономами, физиками и океанографами, стремились измерить и затем изобразить Землю, Вселенную и океаны так, чтобы эти изображения были как можно более информативными и привлекательными. Эмбрион животного — это своего рода маленький мир, чья будущая топология размечена активностью генов развития. Холл употребил подходящую метафору, сказав, что изучение "географии" яйца является центральной темой в биологии и что для этого нам понадобятся новые карты.
В исследованиях любого рода — от изучения космического пространства до погружения в глубины живого организма — появление новых приборов и технологий всегда играло решающую роль. В эмбриологии открытие набора генов развития не просто позволило идентифицировать гены, необходимые для построения организма, но сделало доступным новый способ наблюдения за развитием. Делая видимой работу генов в развивающемся эмбрионе (это те самые зеленые кольца, которые я впервые увидел ночью в Колорадо), мы можем увидеть расположение и форму структур задолго до того, как они сформируются на самом деле. Визуализация генов развития в эмбрионе создает яркую и динамичную карту географии развивающегося организма. На этой карте хорошо видно, как благодаря работе генов развития из простого яйца постепенно формируются сложные животные и сколько в этом процессе логики и порядка.
Первые карты
Процесс развития — от малюсенького яйца до сложного животного — невероятно драматичен. Лягушачья икринка превращается в головастика всего за несколько дней, и важнейшие события на этом пути занимают считанные часы или даже минуты (рис. 4.1). Через час после оплодотворения икринка (всего лишь крупная клетка) разделяется надвое, давая начало двум новым клеткам. Вскоре после этого происходит следующее деление, в перпендикулярном направлении к предыдущему, и у нас уже четыре клетки. Клеток становится 8, 16, 32, и этот процесс продолжается, формируя шар, где клетки образуют оболочку сферы. Затем, всего через девять часов после оплодотворения, начинается удивительная серия морфогенетических движений — гаструляция. В ходе этого процесса образуются внутренний (эндодерма), средний (мезодерма) и внешний (эктодерма) слои эмбриона, из которых постепенно формируются ткани и органы (кожа, мышцы, кишечник и др.). В ходе гаструляции формируется впячивание, благодаря которому клетки, расположенные на поверхности эмбриона, проникают внутрь. Всего через полдня после оплодотворения у эмбриона уже дифференцированы три основных слоя ткани (три зародышевых листка).
Рис. 4.1. Развитие головастика лягушки. Показано постепенное развитие эмбриона, начиная от первого деления яйцеклетки (а), формирования бластулы (с), внутренних зародышевых листков (d, e), нервной системы и сомитов (f-i) и заканчивая формированием глаз и их пигментацией (h-l). Изображения предоставлены Уиллом Грэмом и Барбарой Лом, Колледж Дэвидсона.
На следующих стадиях развития эти три зародышевых листка подразделяются на поля, в границах которых будут формироваться различные структуры. На спинной поверхности эмбриона начинается серия удивительных морфогенезов, в результате которых формируется нервная трубка — зачаток будущего головного и спинного мозга. Проходит лишь один день развития, и вот уже складки и выпуклости обозначают места, где позднее возникнут голова, глаза и хвост. Начинают формироваться органы головастика и его конечности. На второй день формируется спинной плавник, происходит пигментация глаз, появляется сердце и кровеносная система, а в начале третьего дня уже видны эритроциты. Пока происходит формирование органов и конечностей, свободноплавающий головастик может жить только в воде, но потом его хвост исчезает и он принимает форму взрослого животного.
Формирование личинки дрозофилы — тоже стремительный процесс (рис. 4.2). Удлиненное яйцо дрозофилы имеет в начале развития всего одно оплодотворенное ядро, но уже через несколько часов около 6000 клеток формируют плотный эпителиальный пласт вокруг внутреннего желтка. Потом происходит гаструляция с образованием внутреннего, среднего и внешнего зародышевых листков. Туловище эмбриона начинает удлиняться, на нем появляются складки, быстро намечающие границы сегментов. В этом эмбрионе, который существует всего полдня, формируются различные органы личинки и особые группы клеток, из которых потом разовьются структуры взрослого насекомого. Всего через день после оплодотворения из яйца выводится прожорливая подвижная личинка. Это животное быстро растет, дважды линяет, образует куколку, а через девять дней становится взрослой мухой.
Рис. 4.2. Развитие эмбриона мухи и ее жизненный цикл. Вверху: электронные микрофотографии эмбриона, отражающие образование внутренних зародышевых листков эмбриона (a-d) и формирование сегментов тела (e-h). Стадии, показанные на фотографиях a-h, проходят меньше чем за 12 ч. Внизу: эмбрион превращается в личинку, несколько раз линяет и превращается в куколку; через несколько дней из куколки вылупляется взрослое насекомое. Фотографии предоставлены Руди Тернером, Университет Индианы; рисунки Лианн Олдс.
Эмбрионы и личинки лягушек и мух — легкая добыча для хищников. Высокая скорость развития должна обеспечить их выживание, ведь из сотен яиц, отложенных самкой, лишь несколько достигает стадии взрослого животного. Экология человека совершенно другая — наше развитие происходит в условиях максимальной безопасности и протекает, по крайней мере поначалу, гораздо медленнее. Первые деления оплодотворенной человеческой яйцеклетки происходят примерно каждые двадцать часов, так что создание 32-клеточно-го эмбриона человека занимает приблизительно столько же времени, сколько все развитие головастика. Гаструляция у человека начинается примерно на тринадцатый день, а область головы приобретает видимые очертания примерно через три недели. Вдоль спины образуются парные выпуклости, что говорит о том, что мы наблюдаем развитие позвоночного животного (эти сомиты дадут начало позвонкам, прилегающим к ним мышцам и коже). Длина эмбриона в этот момент всего около 2,5 мм, а до рождения человека остается еще восемь (долгих!) месяцев.
Наблюдая за развитием эмбриона, мы задаем очевидные вопросы. Откуда эмбрион знает, где должен быть хвост, а где голова? Или спина и брюхо? Как он определяет, куда поместить глаза, ноги или крылья? Если мы заглянем чуть дальше в будущее оплодотворенного яйца, то нас заинтересует и то, как образуются мышцы, нервы, кровь, кости, кожа, печень и т.д. В какой момент в ходе развития эмбриона решается судьба клеток?
Пионеры в области эмбриологии пытались найти ответы на подобные захватывающие вопросы с помощью простейших экспериментальных методов. Из практических соображений они использовали эмбрионы таких животных, которые легко доступны, с которыми легко работать и за развитием которых удобно наблюдать. Обычно это были водные животные, такие как морские ежи или амфибии, яйца которых при определенных условиях развиваются очень быстро. Среди первых вопросов, которые задавали себе эмбриологи, был следующий: какие структуры формируются из различных участков раннего эмбриона? Ученые придумывали разные способы, чтобы получить ответ, но самый прямой путь заключался в том, чтобы пометить отдельные клетки безопасным химическим красителем и посмотреть, где эти клетки и их потомство окажутся потом. Такие эксперименты позволили эмбриологам создать карты (так называемые карты презумптивных зачатков, или "карты судьбы") эмбрионов на ранней стадии развития, где было видно относительное расположение клеток, дающих начало определенным структурам.
На основании подобных экспериментов были составлены атласы развития эмбрионов многих видов животных. Аналогично параллелям и меридианам на глобусе, координаты на картах эмбрионов указывают расположение будущих тканей, органов и конечностей. На рис. 4.3 показаны карты эмбрионов лягушки и мухи (способ изображения разный, но идея одна и та же). Карта эмбриона лягушки показывает, что кожа, нервная система, элементы крови, сердце и кишечник образуются из клеток, расположенных на определенной широте и долготе эмбриона (т.е. имеющих определенные географические координаты).
Рис. 4.3. "Карты судьбы" ранних эмбрионов лягушки и мухи. Обозначены участки эмбриона, из которых позднее образуются соответствующие части тела. Рисунок Лианн Олдс.
Эмбрион мухи отличается по форме от эмбриона лягушки: он вытянутый и напоминает мяч для регби или американского футбола. Но различные части тела будущего животного точно так же появляются из скрытых меток на карте. Мы видим, что структуры, которые сформируются в разных местах вдоль оси тела животного, возникают из соответствующих участков, расположенных вдоль оси раннего эмбриона.
География эмбриона
Карты зачатков показывают, что, начиная с какой-то стадии развития, клетки "знают", в какой части эмбриона они находятся и к каким тканям или структурам относятся. Если продолжать аналогию с географической картой, клетки, ткани и органы имеют специфические координаты на карте эмбриона, описываемые широтой, долготой, а также высотой и глубиной (координатами над и под поверхностью тела эмбриона). Кроме того, они различаются "национальной принадлежностью" (нервные клетки, клетки печени и т.д.). Однако все клетки эмбриона происходят из единственной оплодотворенной яйцеклетки. Поэтому очевидно, что весь этот набор информации должен формироваться когда-то в процессе развития эмбриона и обеспечить уникальный адрес десятку типов клеток, тканей и органов эмбриона. Как клетки "узнают" свой адрес и понимают, кто они? Это результат коллективной работы генов развития. В порядке их действий существует понятная логика, обеспечивающая последовательную детализацию структур.
Прежде чем я покажу наглядно, как именно работают эти гены, я проиллюстрирую общую логику географии эмбриона (рис. 4.4). Внимательно рассмотрите этот рисунок, прежде чем продолжите читать. Здесь эмбрион изображен в виде глобусов с постепенно уточняющимися координатами.
А теперь давайте посмотрим, как гены развития это делают.
Форма будущих существ: гены развития рисуют полосы, линии, пятна, точки и загогулины
Структура координатной системы эмбриона с ее пересекающимися линиями параллелей и меридианов задает определенный пространственный порядок, в соответствии с которым разворачивается программа работы генов развития. Эту геометрию также отражают физические контуры развивающегося эмбриона, у которого есть углубления, бугорки и сферические выпуклости. Скопления клеток, образующих основные подотделы эмбриона, то есть места расположения развивающихся органов или иных специализированных структур, поначалу часто размечаются простыми геометрическими символами (в виде полос, линий, пятен, точек или кривых), соответствующими участкам экспрессии генов. Фрэнсис Крик, который вместе с Джеймсом Уотсоном и Морисом Уилкинсом получил Нобелевскую премию за открытие структуры ДНК, как-то заметил, что "эмбрионы любят полоски". Это правда. Но эти полоски и другие рисунки — нечто большее, нежели просто приятная глазу картина, на которой мы видим гены развития за работой. Это отражение основных операций, с помощью которых из простого геометрического узора поэтапно создается сложная архитектура животного.
Идет ли речь о крошечной дрозофиле или крупном млекопитающем, общая логика работы генов развития по организации, разделению и спецификации отдельных частей эмбриона становится ясна, если сделать эту работу видимой. Когда на наших глазах каждый ген участвует в создании географии эмбриона, нам проще воспринять весь процесс в целом как результат деятельности множества отдельных операторов. Животное со сложным строением — результат одновременной и последовательной работы различных генов в ходе развития. Я не смогу в одной главе показать полностью, во всех подробностях процесс развития животного на генном уровне. Но мне кажется, в этом и нет необходимости. Я собираюсь описать развитие несколькими крупными мазками. Фокусируясь на этапах, в ходе которых формируются основные признаки животных, мы достаточно живо сможем представить себе, как закладывается будущая форма животного. Приведенные в книге цветные вкладки, иллюстрирующие этот процесс, — лишь малая часть из десятков тысяч фотографий, сделанных исследователями за последние двадцать лет. Это эмбриологический эквивалент спутниковых фотографий Земли. Начнем с географии эмбриона дрозофилы.
Сборка мухи
Если смотреть на только что отложенное яйцо плодовой мушки обычными глазами, оно ничем не выдает той драмы, что разыгрывается у него внутри. На самом деле ключевые гены развития, приведенные в действие оплодотворением, начинают размечать географическую карту развивающегося эмбриона. Хотя все клетки растущего эмбриона содержат одну и ту же ДНК (т.е. одни и те же гены), гены развития активизируются лишь в определенных частях эмбриона и только в определенные моменты времени. За включением и выключением генов развития мы можем наблюдать с помощью мощных современных технологий, позволяющих визуализировать РНК или белковые продукты этих генов в развивающемся эмбрионе. Эти картины отражают порядок и логику создания животного.
Меридианы, ось восток—запад
Спустя два часа после оплодотворения эмбрион дрозофилы в длину (в направлении восток — запад) состоит примерно из 100 клеток. С помощью набора из нескольких генов развития эмбрион уже разделен на западный, центральный и восточный регионы, которые выглядят как полоски из 15-25 клеток (цветная вкладка 4а), причем некоторые из полосок перекрываются. Эти полосы существуют недолго, но прежде чем они исчезнут, активизируется другой набор из семи генов развития, которые экспрессируются полосками, покрывающими восточные две трети эмбриона. Полосы экспрессии шириной в 3-4 клетки разделены "чистыми" промежутками шириной в 4-5 клеток (вкладка 4b). Каждая полоса и соседний интервал покрывают собой пару будущих сегментов; здесь активируются pair-rule-гены ("гены правила пары"). Эти полосы тоже быстро исчезают.
Как только эти прекрасные, регулярно расположенные полоски начинают блекнуть, включается другая группа генов, образующая четырнадцать полосок — некоторые шириной в 1-2 клетки, другие чуть шире; они также занимают восточные две трети эмбриона (вкладка 4с). Будущая личинка сформирует четырнадцать основных сегментов, так что каждая полоса соответствует теперь одному сегменту. Большинство из этих четырнадцати полос сохраняются на протяжении всего периода развития, и через несколько часов после их появления начинается процесс физической сегментации эмбриона. Некоторые полосы точно маркируют границы между сегментами, другие отмечают различные координаты внутри каждого сегмента.
После того как последовательные включения и выключения трех групп генов определили границы сегментов (модулей эмбриона), в дело вступает четвертая группа генов, определяющих специфику модулей, находящихся на разных долготах вдоль оси восток — запад. Это Hox-гены, действие каждого из которых обычно охватывает от двух до семи сегментов и которые остаются активными до конца развития эмбриона (вкладка 4d). Hox-гены определяют, что должно происходить или не происходить в каждом конкретном сегменте или наборе сегментов.
4а Западный и центральный регионы раннего эмбриона дрозофилы маркированы белками двух генов развития (зоны зеленого и красного цвета; область их перекрывания выглядит желтой). Каждый маленький кружок соответствует ядру клетки.
4b На следующей стадии эмбрион дрозофилы подразделяется на пары сегментов с помощью белков нескольких генов развития, которые экспрессируются полосками. соответствующими парам будущих сегментов.
4с Далее эмбрион подразделяется на отдельные сегменты с помощью белков генов развития, маркирующих задний край каждого будущего сегмента. Фотографии 4а-4с предоставлены Джимом Ленжлендом и Стивом Пэддоком.
4d Зоны экспрессии Hox-генов устанавливаются вдоль оси восток-запад. Здесь показана локализация белков четырех Hox-генов (они обозначены четырьмя цветами).
Фотография предоставлена Нипалом Пателом, Калифорнийский университет в Беркли.
Параллели, ось север — юг
В то время как ось восток — запад делится на сегменты, ось север — юг начинает разбиваться на параллели при участии другого набора генов развития. Во многом так же, как первая группа меридиональных генов, первая группа широтных генов размечает обширные зоны эмбриона: северную, экваториальную и южную (вкладка 4е).
Параллели эмбриона не соответствуют повторяющимся модулям, но некоторые из них очерчивают границы будущих зародышевых листков эмбриона. Например, все клетки, экспрессирующие ген, показанный на вкладке 4e, в процессе гаструляции окажутся внутри эмбриона и сформируют средний зародышевый листок, или мезодерму, из которой позднее разовьются мышцы и другие ткани. Клетки, расположенные к северу от них в области экватора, переместятся к югу и сформируют эпидермис брюшной стороны животного и нервный тяж.
Миры в мире: гены развития намечают расположение будущих органов и конечностей
Когда параллели и меридианы нанесены, а интервалы между ними уточнены, появляется информация, позволяющая определять положение на теле эмбриона с учетом обеих осей. Теперь можно размещать органы и другие структуры, и тут берутся за дело ключевые гены развития, ответственные за построение органов. В зависимости от количества будущих структур каждого типа, задается одна или несколько пар координат, маркирующих положение "строительных площадок".
Например, в грудном отделе дрозофилы располагаются три пары ног — по одной паре на каждый сегмент. В развивающемся эмбрионе ответственный за построение конечностей мастер-ген Distal-less (вспомните третью главу) включается в нескольких местах — ближе к южному окончанию трех сегментов, расположенных в западной части эмбриона (вкладка 4f, внизу). Обратите внимание, что в восточных сегментах Dll не активируется. Причина заключается в том, что Hox-белки строго контролируют ситуацию в каждом сегменте и не позволяют гену Dll включиться восточнее области груди (здесь формируются брюшные сегменты, не имеющие ног).
У дрозофилы две пары крыльев, и можно увидеть, как мастер-ген, вовлеченный в формирование крыла, получает сигнал включиться только в клетках, расположенных к северу от того места, где ген Dll помечает место создания будущих ног во втором и третьем грудных сегментах, но не восточнее (вкладка 4f, вверху). Относительное расположение зачатков крыльев и ног соответствует относительному расположению этих конечностей на теле взрослой дрозофилы (крылья на спине, ноги на брюхе).
Будущие ноги и крылья на этом этапе еще совсем крошечные: в одной конечности едва наберется 15-20 клеток. Но за несколько дней они вырастают в тысячу раз и становятся больше, чем был весь эмбрион в тот момент, когда они начали формироваться. В дальнейшем эти структуры станут отдельными частями тела. Их организация зависит от новой системы координат теперь уже в самом крыле, ноге или каком-либо органе. Эта внутренняя система координат устанавливается, когда часть тела еще только намечается. Клетка получает информацию о том, в какой части сегмента она находится, и по мере роста структуры эта информация уточняется. Например, небольшой кластер из 20 клеток крыла разрастется до 50 000 клеток, ограниченных зонами экспрессии генов развития с запада (перед), востока (зад), севера (спина) и юга (брюхо) (вкладка 4g). Линии широты и долготы внутри этих структур служат как для обозначения физических границ (например, для маркировки края крыла), так и для нанесения разметки, по которой пройдет дальнейшая детализация структуры.
Система координат в растущей конечности достаточно подробная, чтобы установить расположение и функцию рядов, кластеров и даже отдельных клеток. Например, крыло дрозофилы имеет две характерные особенности — сеть жилок, которые придают крылу жесткость при быстрых движениях в полете, а также ряды сенсорных щетинок на переднем крае крыла. Положение жилок и расстояние между ними задаются генами развития задолго до того, как эти жилки начинают формироваться, примерно за неделю до того, как муха впервые полетит. Ряды щетинок на передней части крыла располагаются особым образом относительно обеих осей крыла: они формируются по обе стороны от экватора, но не на восточной половине крыла. Гены, которые помогают построить щетинки, активируются в этих координатах задолго до того, как щетинки становятся заметны (вкладка 4h).
4е Координаты широты в раннем эмбрионе определяются генами развития. экспрессирующимися в южной (вверху) экваториальной (в центре) и в северной (внизу) зонах эмбриона. Фотография предоставлена Майком Левайном, Калифорнийский университет в Беркли.
4f Будущее расположение конечностей намечается за счет белков генов развития, которые синтезируются в областях эмбриона, имеющих определенные широту и долготу. Например, два разных белка намечают расположение будущих передних и задних крыльев (П и З соответственно) и ног (Н). Фотография Скотта Уэзерби.
4g За счет белков различных генов развития определяются верхняя (красная) и нижняя (пурпурная) поверхности, а также передняя (слева) и задняя (справа от вертикальной зеленой линии) зоны будущего крыла. Каждое маленькое пятнышко соответствует ядру клетки крыла. Фотография Джима Уильямса и Стива Пэддока.
4h В определенных координатах крыла включаются гены развития, способствующие формированию определенных структур. Здесь показан белок одного из генов развития (области зеленого и желтого цвета), который способствует формированию щетинок на будущем краю крыла (там, где заканчивается красная область). Фотография Сета Блера Университет Висконсина.
Спецификация повторяющихся модулей
Две пары крыльев дрозофилы очень сильно различаются по форме и функции. Передние крылья широкие, плоские, укреплены жилками и намного сильнее задних. Задние крылья гораздо меньше, имеют закругленную форму, без жилок. Их функция — удерживать муху в равновесии, корректируя высоту и угол движения в полете (дрозофилы без задних крыльев врезаются в землю). Развитие задних и передних крыльев начинается похожим образом. Система координат в двух типах крыльев совершенно одинаковая (если судить по картине экспрессии генов; вкладка 4i). Однако у взрослой особи задние и передние крылья очень сильно различаются по размеру, форме и функциональным характеристикам.
Различие между задними и передними крыльями, формирующимися в двух соседних сегментах (т.е. на разной долготе), связано с активностью Hox-гена, называемого Ultrabithorax (Ubx). Этот Hox-ген активируется во всех клетках задних крыльев, а в передних — нет (вкладка 4j). Действие Гена (Ubx модифицирует программу развития задних крыльев таким образом, что экспрессия набора генов, обеспечивающих разметку крыла, подавляется, а другие гены начинают работать очень специфически. К примеру, в задних крыльях не активируются гены, участвующие в образовании жилок, а "гены щетинок" не активируются вдоль передней кромки крыльев. Различие в развитии передних и задних крыльев в результате действия гена Ubx иллюстрирует, каким образом фундаментальная особенность строения животных, а именно, дифференцировка сериально повторяющихся частей, контролируется Hox-генами в регионах, имеющих специфические координаты относительно передне-задней оси тела. Принцип, на котором основано построение тела дрозофилы, распространяется и на нас с вами.
4i Переднее и заднее крылья различаются по размеру но их разметка происходит с помощью белков одних и тех же генов развития (сравните расположение пурпурных, красных и желтых/зеленых участков в обоих крыльях). Фотография Джима Уильямса и Стива Пэддока.
4j Белок одного из Hox-генов определяет различия между передним (второе слева) и задним (первое справа) крылом. Крупный неокрашенный диск на рисунке слева превратится в переднее крыло; ни в одной из клеток этого диска не синтезируется Ultrabithorax (обозначенный желтым цветом). Напротив, во всех клетках, из которых будет формироваться заднее крыло (ярко-желтый диск на втором справа рисунке), этот белок экспрессируется. Фотография Скотта Уэзерби.
Сборка позвоночных животных
Хотя яйца разных позвоночных по размеру и другим характеристикам очень сильно различаются между собой (сравните мелкие яйцеклетки млекопитающих с огромными, покрытыми скорлупой яйцами крупных птиц и пресмыкающихся), а взрослые животные могут быть столь разными, как гуппи и слоны или динозавры, на определенной стадии развития эмбрионы всех позвоночных весьма похожи друг на друга. На этой стадии в направлении восток — запад образуется основная ось тела (голова — хвост), определяется положение различных тканей (ось север — юг), таких как нервная трубка и хорда (плотная струна из специфических клеток, проходящая вдоль спины всех позвоночных), а вдоль тела появляются регулярно расположенные парные бугорки сомитов. Сначала я вкратце расскажу об этапах этого процесса, чтобы проиллюстрировать формирование основного плана строения позвоночных. Эти этапы включают в себя дифференцировку основных осей тела, подразделение головного мозга и формирование сомитов, из которых позднее возникают позвонки, ребра и другие модули основной оси тела. Затем я подробнее остановлюсь на формировании конечностей и покажу, каким образом происходит детализация отдельных элементов формирующейся структуры. Чтобы нарисовать общую картину, я воспользуюсь данными, полученными при изучении лягушек, рыб, мышей и кур. Принципы развития у разных видов очень похожи, но некоторые события легче понять или увидеть на примере каких-то определенных животных. Нам с вами важно получить общее представление о формировании плана строения позвоночного, и мы не будем обращать внимание на отдельные различия в деталях.
Образование осей и слоев тканей эмбриона
Многое из того, что нам известно об образовании осей тела и формировании трех зародышевых листков у позвоночных, впервые было показано в экспериментах на лягушках. Амфибии, как правило, формируют крупные яйцеклетки и откладывают много икринок. Именно поэтому амфибии гораздо лучше подходят для экспериментального изучения, чем млекопитающие с их мелкими, немногочисленными яйцами, которые развиваются внутри организма матери. Хотя после гаструляции все эмбрионы позвоночных имеют сходную организацию, они доходят до этой стадии разными путями, что связано с разным содержанием желтка в яйцеклетке. Но хотя ранние стадии развития эмбриона лягушки отличаются от таковых у эмбриона мыши, наборы генов развития, вовлеченных в дифференцировку осей тела и зародышевых листков, практически одинаковые.
Оси тела и зародышевые листки эмбриона позвоночных возникают в результате каскада процессов, в ходе которых синтез одной молекулы индуцирует синтез другой и т.д. Сначала дифференцируется ось север — юг, затем — ось восток — запад. К ключевым молекулам на этом этапе относится продукт одного из генов развития — белок Chordin (хордин). Он синтезируется клетками в области дорсальной губы бластопора (вкладка 4k). Как показали Шпеман и его ученица Хильда Мангольд, этот регион (регион-организатор) способен организовывать ось север — юг. В формировании оси голова — хвост задействованы другие белки, такие как белок Frzb, который синтезируется там, где позднее возникнет голова эмбриона (вкладка 4l).
Разметка отделов головного мозга
Одним из первых органов, образующихся в ходе развития эмбриона, является нервная трубка. Позднее эта трубка дает начало головному и спинному мозгу. Головной мозг сначала разделяется на три основных отдела — передний, средний и задний мозг. Дальше эти отделы подразделяются на доли, ответственные за различные функции — от обоняния и зрения до контроля таких непроизвольных процессов, как дыхание и сердцебиение. Еще до того, как подобное подразделение головного мозга станет заметно, и задолго до того, как каждый отдел начнет выполнять свою функцию, гены развития начинают размечать участки нервной трубки, которым предстоит стать отделами мозга. Например, один ген экспрессируется в той части, которая станет передним и средним мозгом, а другой маркирует задний мозг и границу среднего и заднего мозга. К востоку от этой границы возникает мозжечок.
Другие гены развития экспрессируются в виде полос, которые отмечают положение и границы ромбомеров — семи подотделов заднего мозга, имеющихся у всех позвоночных. Некоторые полосы распространяются на пары соседних ромбомеров, другие отмечают пары альтернативных ромбомеров (вкладка 4m). Отдельные модули заднего мозга разграничиваются за счет экспрессии Hox-генов. Вспомните, что большинство позвоночных имеют четыре кластера Hox-генов. Кластеры принято обозначать буквами а — d, а гены внутри кластеров — номерами (1-13). В заднем мозге экспрессия соседних Hox-генов маркирует отдельные ромбомеры и перекрывающиеся группы ромбомеров, как показано на вкладке 4n. В частности, ген Hoxa2 экспрессируется в ромбомерах (г) r2 — r4, ген Hoxb2 — в ромбомерах r3 — r4, ген Hoxb1 — только в r4, ген Hoxb3 — в r5 и r6, а ген Hoxb4 — в r7 и восточнее, в области спинного мозга. Этих пяти генов достаточно, чтобы создать уникальный "Hox-код" для каждого ромбомера от г2 до r7. Другие гены маркируют r1 (будущий мозжечок). Та же самая логика — сначала сформировать набор идентичных модулей, а затем сделать их отличающимися друг от друга, — применяется и в ходе формирования и дифференцировки модульного плана строения позвоночного животного.
4k В клетках организатора эмбриона лягушки синтезируется белок Chordin — продукт одного из генов развития.
4l Белок другого гена развития, Frzb, синтезируется в клетках той части эмбриона лягушки, где позднее образуется голова. Фотографии 4k и 4l сделаны Эдди де Робертисом, Калифорнийский университет в Лос-Анджелесе.
4m Гены развития размечают границы отделов заднего мозга позвоночных. Здесь показана экспрессия трех генов (полосы синего, черного и оранжевого цвета), маркирующих ромбомеры г2, гЗ и г5.
4n Зоны экспрессии Hox-генов в заднем мозге позвоночных. На каждой картинке ромбомеры гЗ и г5 маркируются экспрессией гена развития Krox 20 (розовый или оранжевый цвет). Пять зон экспрессии других Hox-генов показаны лиловым цветом и располагаются от участка г2 (Hoxa2) до г7 (Hoxb4). Фотографии 4т и 4п предоставлены Сесилией Моунс Медицинский институт Говарда Хьюза, Онкологический центр Фреда Хатчинсона, Сиэтл.
Разметка сегментов эмбриона позвоночных. По одному сомиту за раз
Сомиты — это "кирпичики", из которых строится тело позвоночного животного. Из них возникают модульные части позвоночника, ребра и некоторые группы мышц. Они появляются вдоль основной оси эмбриона в виде расположенных через равные промежутки парных бугорков, причем формируются последовательно, от головы к хвосту (с запада на восток) у всех видов позвоночных животных. У каждого вида сомиты образуются со строго определенной скоростью: через каждые двадцать минут у рыбки данио, примерно через каждые полтора часа у курицы и через каждые два часа у мыши. Всего у человека образуется в среднем 42 сомита, у мыши — 65, а у змей — до нескольких сотен.
Высокая точность "расписания" закладки сомитов и порядок их возникновения от головы к хвосту предопределяются экспрессией специфического набора генов развития. Несколько генов начинают экспрессироваться в еще не сегментированной части эмбриона, и уровень их экспрессии осциллирует в каждом раунде образования сомитов. Спереди от этой зоны появляются полоски экспрессии других генов, которые маркируют границы формирующегося сомита, а дальше, по направлению к голове, стабильные полоски экспрессии маркируют границы ранее сформировавшихся сомитов. Моментальные снимки, отражающие экспрессию генов развития, позволяют пошагово следить за ходом формирования сомитов (вкладка 4o).
Сначала все сомиты выглядят одинаково, но они дают начало разным позвонкам, ребрам и мышцам — в зависимости от их положения вдоль оси голова — хвост. Судьба конкретного сомита предопределяется характером экспрессии Hox-генов вдоль основной оси тела (ось восток — запад). Определенные Hox-гены включаются на западных (передних) границах определенных сомитов, и зона их экспрессии обычно распространяется в восточном (заднем) направлении (вкладка 4p).
Ступенчатость границ экспрессии Hox-генов приводит к тому, что в разных сомитах экспрессируется своя уникальная комбинация Hox-генов. Более того, четкие передние границы экспрессии отдельных Hox-генов часто маркируют границы между разными типами структур скелета позвоночного. Например, граница экспрессии гена Hoxc6 у всех позвоночных соответствует границе между шейными и грудными позвонками.
Собираем конечности: эта кость соединяется с...
Когда план строения уже заложен, а повторяющиеся модули тела позвоночного — сомиты — еще только формируются, начинается маркировка тех участков тела эмбриона, где будут располагаться различные органы и конечности. Активируются гены развития, необходимые для создания трехмерных структур, и начинается конструирование частей тела.
Как и мы с вами, мыши и другие позвоночные обладают множеством органов. Но я сконцентрируюсь исключительно на развитии конечностей. Четвероногость позвоночных — древний признак, и в развитии конечностей у всех позвоночных есть много общего. Подробнее всего процесс развития конечностей исследован у мышей и кур, и поэтому, описывая создание этих удивительных анатомических структур, я буду опираться на данные, полученные именно для этих двух видов животных.
Формирование конечности начинается с малюсеньких бугорков (почек конечностей) по бокам эмбриона, положение которых задается двумя специфическими координатами по оси восток — запад. У разных позвоночных передние конечности формируются на уровне пар сомитов с разными номерами, но всегда на границе шейного и грудного отдела. Самый западный бугорок становится передней конечностью (ногой у мыши, крылом у курицы), а самый восточный — задней конечностью (ногой в обоих случаях). На очень ранней стадии развития эмбриона мы можем наблюдать экспрессию одного из генов развития, который маркирует те места, где образуются крошечные утолщения ткани — подушечки, из которых будет формироваться конечность (вкладка 4q). Почки конечностей, хотя поначалу и очень маленькие, сразу имеют трехмерную структуру и три оси, вдоль которых верхние (тыльная сторона), нижние (ладонь), передние (большой палец), задние (мизинец), проксимальные (например, плечо) и дистальные (пальцы) элементы начинают расти по мере активного увеличения размеров почки. Дифференцировкой этих осей в зачатке конечности занимаются специфические гены развития. Например, сигнальная молекула Sonic Hedgehog производится в самой задней части почки конечности (вкладка 4q), сигнальный белок FGF8 — вокруг апикального гребня почки конечности (вкладка 4r), а ген Lmx активируется только в клетках верхней половины конечности (вкладка 4s).
В развитии длинных костей, пальцев, суставов, мышц и сухожилий конечностей участвуют другие гены. Развитие этих элементов протекает в проксимально-дистальном направлении, так что сначала определяется положение плеча и бедра, затем предплечья и голени и, наконец, кисти руки и стопы. Кость образуется в результате конденсации клеток, которые сначала образуют хрящевую ткань, постепенно сменяющуюся костной тканью. Сначала конечность представляет собой хрящевую структуру. Экспрессия гена Sox9 предопределяет пространственную структуру процесса конденсации клеток (вкладка 4t) еще даже до того, как будущая конечность становится видимой на клеточном уровне. Между зонами конденсации появляются суставы, но еще до того, как эти зоны становятся видны на клеточном уровне, полосы экспрессии гена GDF5 помечают расположение будущего плеча, локтя, запястья и суставов кисти и пальцев в передних конечностях, а также колена, лодыжки и суставов стопы в задних конечностях (вкладка 4u). Будущее расположение сухожилий, связывающих мышцы с костями конечностей, определяется экспрессией гена scleraxis, также входящего в число генов развития (вкладка 4v).
Своей красотой конечность, кроме всего прочего, обязана смерти. Разделение пальцев у эмбриона мыши, курицы и человека является следствием отмирания ткани, расположенной между пальцами. В межпальцевых зонах кистей и стоп экспрессируются особые гены, которые приказывают клеткам, находящимся в этих промежутках, исполнить программу клеточной смерти (вкладка 4w). Ткань между пальцами исчезает, как будто ее вырезали ножом. Интересно, что у уток в зонах между пальцами экспрессируется дополнительный ген, блокирующий сигнал клеточной смерти, и в результате на лапах утки остаются межпальцевые перепонки.
Хотя все конечности состоят из одних и тех же элементов — костей, сухожилий, мышц, суставов и т.д., размер, форма и число этих элементов в разных частях конечностей различаются. Например, плечо состоит из одной длинной кости, предплечье — из двух длинных костей, а кисть имеет до пяти пальцев. За размер, форму и число элементов конечности отвечает группа Hox -генов (в первую очередь Hoxa9-13 и Hoxd9-13), зоны экспрессии которых в процессе развития как задних, так и передних конечностей формируют очень сложную картину и частично перекрывают друг друга. Кроме того, у большинства видов животных передние и задние конечности также устроены по-разному. Наши руки и ноги, кисти и стопы, пальцы рук и ног — это разные вариации одной и той же структуры. У других животных, таких как птицы, кенгуру или динозавр Tyrannosaurus rex, различие между передними и задними конечностями еще заметнее. Это связано с тем, что в передней или задней конечности происходит избирательная экспрессия определенной группы генов развития, что и определяет формирование различий между этими сериально гомологичными структурами.
4о Процесс формирования сомитов маркирован экспрессией генов развития в каждом развивающемся сомите, включая те, которые еще только предстоит сформировать. Фотография предоставлена Оливье Пуркье Институт Стауэрсов, Канзас-Сити, Миссури.
4p Зоны экспрессии определенных Hox-генов располагаются вдоль туловища в определенных сомитах. Фотография предоставлена Оливье Пуркье, из статьи Cell 106 (2001): 219-32 с разрешения издательства.
4q Экспрессия гена развития помечает расположение развивающихся почек крыльев и ног. Фотография предоставлена Джоном Фоллоном, Университет Висконсина.
4r Два важнейших участка почки конечности цыпленка маркируются экспрессией генов развития. Ген Sonic hedgehog экспрессируется в зоне поляризующей активности, а ген FGF8- в апикальном эктодермальном гребне почки конечности.
4s Ген развития Lmx помечает верхнюю половину конечности. Показаны почки двух конечностей: обратите внимание на лиловую окраску верхней части каждой из них. Фотографии 4r и 4s предоставлены Клиффом Табином, Медицинский факультет Гарвардского университета, Кембридж, Массачусетс.
4t Последовательные стадии развития конечности и формирование хрящевой ткани визуализируются благодаря экспрессии генов развития. На первой картинке показаны области экспрессии гена Sox9 в почке конечности, маркирующие будущие отделы верхней конечности. На остальных картинках отражено последовательное формирование предплечья, кисти и пальцев. Фотографии предоставлены Хуаном Урле, Университет Кантабрии, Сантандер, Испания; из статьи Developmental Biology 257 (2003): 292-301 с разрешения издательства.
Завершающий этап: проработка деталей
Одно из самых поразительных свойств строения тела животного — это его упорядоченность на всех уровнях, от общего плана до мельчайших деталей отдельных частей. Прекрасные примеры — расположение чешуек на крыльях бабочек и перьев на теле птиц. Хотя местонахождение клеток задается достаточно точно, задание координат — не единственный способ, каким достигается упорядоченность. Расстояние между отдельными элементами какой-либо системы часто определяется механизмом так называемого латерального ингибирования. Принцип этот прост, но его эффект удивителен.
Представьте себе толпу людей. Каждого человека попросили отодвинуться от соседей, окружающих его со всех сторон, на расстояние вытянутой руки. В результате каждый создает вокруг себя зону отчуждения с радиусом в протянутую руку, куда не проникает никто другой. Таким образом, возникает группа людей, отстоящих друг от друга на равные интервалы (если мы условимся, что все руки одинаковой длины, как на рис. 4.5).
Рис. 4.5. Создание упорядоченного рисунка. В исходно равномерном поле клеток (первый квадрат) начинается дифференцировка двух клеток (черные круги на втором квадрате), что препятствует дифференцировке других клеток, находящихся с ними в непосредственном контакте. В других местах клетки также начинают дифференцировать, ингибируя дифференцировку ближайших соседей (третий квадрат), что в конечном итоге приводит к регулярному распределению дифференцировавшихся клеток (последний квадрат). Теперь эти клетки могут образовывать щетинки, перья или другие структуры. Рисунок Джоша Клейса.
То же самое делают клетки, устанавливая порядок на микроскопическом уровне. Механизм этого процесса заключается в том, что клетки, которые должны сформировать определенные структуры, образуют вокруг себя зоны ингибирования. Только клетки, находящиеся вне действия такой зоны, способны формировать такую же структуру. В результате получается регулярный рисунок — волоски на теле животных, пух, перья и чешуйки у птиц, пресмыкающихся и млекопитающих, а также изумительные сложные глаза членистоногих. Любой из этих рисунков создается на локальном уровне в результате клеточных взаимодействий, а не специфицируется глобальными координатами. У эмбриона созданию такого рисунка предшествует формирование пространственно-упорядоченного узора экспрессии генов, задействованных в дальнейшем развитии структуры. Например, ген Sonic hedgehog экспрессируется на очень поздней стадии развития куриного эмбриона в каждом зачатке будущего пера еще до появления перьев (вкладка 4x).
4u Ген развития GDF5 помечает будущие суставы пальцев. Фотография предоставлена Хуаном Урле, Университет Кантабрии, Сантандер, Испания; из статьи Developmental Biology 257 (2003): 292-301 с разрешения издательства.
4v Ген развития scleraxis маркирует расположение будущих сухожилий конечности и ее пальцев.
4w Ген развития BMP 4 маркирует те ткани между пальцами, которые должны исчезнуть.
4x Ген развития patched намечает расположение развивающихся зачатков перьев на спине цыпленка. Фотографии 4v-4x предоставлены Клиффом Табином, медицинский факультет Гарвардского университета, Кембридж, Массачусетс.
Сложное из простого: наблюдаем невидимое
Франсуа Жакоб заметил, что любое объяснение, будь оно мифологическим, магическим или научным, основано на одном и том же принципе. Говоря словами Жана Перрена, люди всегда пытаются "объяснить сложное видимое через что-то простое невидимое". Я бы возразил, что революция в нашем представлении о развитии животных стала возможна по той причине, что мы смогли сделать еще один шаг — мы сделали "простое невидимое" видимым. Возможность видеть полосы, пятна, линии и другие рисунки, которые соответствуют зонам экспрессии генов развития и в точности предсказывают будущее положение и форму сегментов, органов и других частей эмбриона, подарила нам много открытий, сделавших роль генов в процессах развития кристально ясной. Полосы, ограничивающие будущие сегменты, пятна, соответствующие зонам организующей активности, а также другие рисунки, отмечающие положение костей, суставов, мышц, органов, конечностей и др., — все это связывает невидимые гены с созданием видимой формы.
Более того, ставший видимым порядок действия генов развития животных оказался абсолютно логичным. Как при строительстве зданий, где есть определенная последовательность работ (закладка фундамента, возведение несущих стен и балок, укладка полов, размещение основных труб, проводов и перегородок), так и при сборке животного сначала выстраивается общий план и лишь в конце прорабатываются детали. Логика этого процесса объясняет, как мутации генов развития могут привести к появлению ужасных монстров. Если какая-то стадия работы пропущена, все зависящие от нее стадии протекают не так, как положено.
Я уже говорил, что функции отдельных генов развития легко понять, если проследить за их работой, и привел множество простых примеров. Однако создание целого животного — это действительно сложный процесс. Эта сложность является результатом одновременного и последовательного действия многих генов развития — десятков генов, работающих в одном и том же месте в одно и то же время, значительно большего числа генов, действующих в одно и то же время в разных местах, и сотен генов, действующих последовательно по ходу развития эмбриона. Именно цепи параллельных и последовательных операций позволяют создать сложный организм.
Теперь, когда вы пристально рассмотрели работу генов развития, имеет смысл задуматься о цепочках, которые образуют работающие гены. Как отдельные звенья цепи связаны между собой? Откуда гены узнают о том, в каком порядке, где и когда им следует включаться?
В создании животного принимает участие еще одна группа генетических невидимок — маленьких ДНК-устройств, определяющих время и место активации генов. В следующей главе я расскажу об этих удивительных маленьких устройствах в геноме, которые определяют изумительный рисунок экспрессии генов, связывают между собой цепи генов развития и обеспечивают сложность и разнообразие строения животных.
Темная материя Вселенной и генома. Вверху: фотография галактического кластера CL0024+1654; темная материя выглядит как мутное пятно в центре снимка. Внизу: микрочип, содержащий геномную ДНК дрозофилы; светлые пятна соответствуют ДНК, кодирующей различные гены, темные пятна соответствуют некодирующей ДНК. Верхняя фотография предоставлена Европейским космическим агентством, NASA и Жан-Полем Крейбом (обсерватории Миди-Пиренеи (Франция)/Калтех (США)). Нижняя фотография предоставлена Томом Джинджерсом и компанией Affymetrix.