, но в двух статьях 2016 г. Джошуа Шиффман и Винсент Линч показали, почему у слонов этот ген особенный.
Как оказалось, у слонов в организме ген TP53 содержится не в одном, а в целых 20 экземплярах. Кроме того, слоны вырабатывают избыточный запас белка, кодируемого TP53 (он называется p53). Таким образом, слоновьи клетки более активно сканируют ДНК, отыскивая в ней повреждения. Действительно, как показали исследования, слоновьи клетки более чувствительны к нарушению структуры ДНК при облучении. Темпы апоптоза у них гораздо выше, чем в человеческих клетках. У человека аналогичный ген есть всего в двух экземплярах (как и большинство других генов – по одному экземпляру от матери и от отца), поэтому возникает очевидный вопрос: можно ли добавить в человеческие клетки дополнительные копии гена TP53 и тем самым повысить их устойчивость к раку? Пока считается, что да, хотя на практике этот процесс может оказаться сложнее, чем просто подсадить в клетку еще несколько экземпляров того же самого гена. Шиффман и Линч внедряли вариант слоновьего гена в мышиные клетки и наблюдали, что у этих клеток действительно меняется реакция на облучение: активизируется апоптоз, реализуемый каспазой-3 (фермент из класса протеаз, способных разрезать молекулы белков). Так удалось показать, что при наличии дополнительного гена отклик на радиацию усиливается.
Правда, баланс биохимических ингредиентов и дозировка при управлении уровнями экспрессии человеческих генов не менее важны, чем при приготовлении коктейлей в поздний час. Действительно, если судить по современным данным, при добавлении генов в человеческие клетки или изменении экспрессии генов в обычных клетках есть риск переборщить. Всякий раз, вмешиваясь в работу генома, необходимо соблюдать меру и гарантировать, что дозировка (активность) гена останется на приемлемом уровне.
Существуют и естественные механизмы, позволяющие тщательно поддерживать в человеческих клетках такую дозировку. Например, у женщин в ядре каждой из клеток – по два экземпляра хромосомы X, а у мужчин – всего по одному. Мужская хромосома Y не компенсирует эту разницу, поскольку в ней всего около 200 генов против более 1000 генов в X-хромосоме. Следовательно, если бы у обоих полов обе хромосомы проявляли бы примерно одинаковую активность, то две X-хромосомы у женщин работали бы «с избытком». Чтобы скорректировать эту разницу, вторая X-хромосома управляется при помощи «компенсации дозы». Благодаря такому регулирующему механизму большинство генов в X-хромосомах работают с пониженной активностью, чтобы их эффект был сравним по степени выраженности с активностью одной X-хромосомы у мужчин. Правда, нельзя просто взять и удалить одну хромосому целиком, чтобы уравнять «дозу» генетической активности, – это неверный подход к достижению баланса. В самом деле, если девочки рождаются с единственной X-хромосомой, то у них развивается болезнь, называемая синдром Шерешевского–Тернера. Таким образом, дозировка экспрессии генов – это строго контролируемый процесс.
Как показали дальнейшие исследования, в случае с геном TP53 неконтролируемо высокие уровни экспрессии ускоряют старение. Как в таком случае слонам удается доживать до почтенного возраста и при этом не болеть раком? Оказывается, не все копии гена TP53 у слонов идентичны: некоторые из них представляют собой ретрогены (разновидность псевдогенов). Некоторые подстраховывают более функциональные формы p53, позволяя белку p53, в сущности, тихонечко дожидаться, пока возникнет генетическая нестабильность, а до того не провоцировать чрезмерную реакцию. У голых землекопов, также отличающихся исключительной устойчивостью к раку, обнаружен свой уникальный механизм обработки p53, пока еще не вполне понятный. Но, вероятно, он похож на аналогичный механизм у слонов. Если изучать клетки одного вида в контексте эволюционной истории другого вида и усваивать эти «уроки генетики», то можно выработать методы, позволяющие защитить клетки человека и других живых существ от неизбежного вреда, который несет межпланетное путешествие.
Совершенно иная идея по разработке внутренней генетической защиты почерпнута из изучения тихоходок (Ramazzottius varieornatus), которых часто называют «водяными медведями», поскольку они живут в воде и немного напоминают микроскопических мишек. У тихоходок есть даже собственный аккаунт в «Твиттере» (@tardigradopedia). Они выживают практически везде, даже в открытом космосе, переносят жесткое излучение и обезвоживание (высушивание). Такие экстремофильные способности тихоходок известны с начала XX в. Считается, что их устойчивость к обезвоживанию и облучению имеет одни и те же механизмы, но до сих пор остается загадкой, как эти малютки обзавелись такими потрясающими способностями. Как только в 2015 г. был секвенирован геном тихоходок, сразу несколько исследовательских групп (в том числе японские команды под руководством Ацуси Тоёды и Такекадзу Куниэды, а также группа из Северокаролинского университета во главе с Бобом Голдштейном) принялись разбираться в их суперсилах.
Считается, что высокая устойчивость тихоходок к рентгеновскому и прочему облучению – это побочный эффект адаптации к сильному обезвоживанию. Дело в том, что при высыхании организма большинство биомолекул в нем может повредиться или разрушиться. Подобно тому, как сухая кожа порой трескается, шелушится и даже кровоточит, в высыхающих клетках повреждаются молекулы. ДНК, РНК, белки и прочие компоненты внутриклеточной среды из-за быстрого обезвоживания могут разрываться и надламываться, как под действием рентгеновского излучения.
Как же в таком случае тихоходки справляются одновременно и с иссушением, и с жестким излучением? Как узнать, какие гены в наибольшей степени за это отвечают? Логичнее всего проследить, какие гены активируются при обезвоживании, и сосредоточиться именно на них. Так сначала и стал действовать Куниэда с коллегами. Но изменения экспрессии генов при обезвоживании и последующей регидратации не были сколько-нибудь значительными. Таким образом, тихоходка способна входить в состояние обезвоживания и без серьезных корректировок в работе генов. Учитывая это, исследователи предположили, что более перспективны поиски гена, характеризующегося постоянной экспрессией, – такие гены еще называют генами домашнего хозяйства. Дело в том, что они активны в клетке всегда, так как нужны для «поддержания порядка», и работают подобно неутомимым горничным.
Именно в таком ракурсе удалось выявить уникальные гены тихоходок. В большинстве своем они отличаются постоянной активной экспрессией, непрерывно производят белки. Кроме того, они активны как на этапе зародышевого развития, так и у взрослой тихоходки. Но среди десятков уникальных белков, продуцируемых этими специфичными для тихоходок генами, нашелся всего один Dsup – белок подавления ущерба (его называют радиопротекторный), который компактно расположен рядом с ядерной ДНК. Такая локализация явно указывала, что он может тесно взаимодействовать с ДНК и даже, возможно, защищать ее.
Затем были запущены два эксперимента. Первый был призван показать, в самом ли деле Dsup может повышать резистентность к облучению, а второй – сохранится ли такая защитная функция в совершенно новой среде, т. е. в человеческой клетке. Для этого сначала требовалось создать человеческие клетки, содержащие белок Dsup, а затем подвергнуть культуру воздействию рентгеновских лучей. Такие лучи могут вносить хаос в геном двумя путями. Необходимо отметить, что энергия излучения может либо напрямую поглощаться ДНК (непосредственное воздействие) и таким образом повреждать молекулу с наследственной информацией, либо действовать опосредованно, провоцируя выделение активного кислорода из молекул воды. При помощи методов генной инженерии, о которых мы поговорим ниже, японским исследователям удалось создать клеточную линию HEK293, где ген Dsup экспрессируется под контролем «конститутивного CAG-промотора». Поэтому он должен сохранять активность в человеческих клетках и делать их по свойствам похожими на клетки тихоходок.
Затем приступили к облучению. Как и ожидалось, под воздействием перекиси водорода (H2O2) в контрольной группе клеток HEK293 большая часть ДНК (71 %) претерпела сильную фрагментацию. В противоположность этому в клетках, экспрессирующих ген Dsup, фрагментация ДНК была в значительной степени подавлена: только 18 % от общего объема ДНК оказалось повреждено. Следовательно, можно заключить, что белок Dsup защищает клеточную ДНК как от активного кислорода, так и от рентгеновского излучения. В качестве эксперимента по «спасению» исследователи также попытались предварительно обрабатывать облучаемые клетки антиоксидантом N-ацетил-L-цистеином (NAC), который, как ожидалось, существенно купирует вызываемые пероксидом однонитевые разрывы ДНК. Но суперсилы этих веществ можно сочетать: при одновременном применении NAC и Dsup патологические изменения подавлялись еще эффективнее. Количество разрывов сокращалось на 40 %. Человеческие клетки, экспрессирующие Dsup, не только значительно меньше страдали от жесткого излучения, но и демонстрировали повышенную живучесть и способность к пролиферации (росту) после облучения.
Это был первый результативный опыт, когда ген тихоходок, внедренный в человеческую клетку для радиационной защиты, не ингибировал рост и не нарушал ни морфологию, ни базовые функциональные свойства клетки. Однако это было внедрение одного гена в одну клеточную линию. Трудно сказать, что могло бы произойти с целым человеческим организмом. Конечно, можно извлечь потрясающие уроки из таких экспериментов и из знаний о геномах слонов и тихоходок, но что нас ждет, если на этом не останавливаться? Как одновременно работать с большим количеством генов? Можно ли усовершенствовать этот метод?
Работа, проведенная в моей лаборатории в Корнеллском университете, показала, что полученное ранее 40 %-ное снижение ущерба для ДНК можно довести до 80 % или даже до 85 %, улучшая интеграцию и регуляцию гена Dsup, а также модифицируя другие гены в геноме человека. Именно в этом суть работ, намеченных на 2021–2040 гг., когда все человеческие гены превратятся в поле для создания новых человеческих генов и формирования новых функций в клетках.