Но для начала разберем, как это сделать.
Если сравнить организм с миской бульона, то генетическое «преобразование» – это способ переноса ингредиентов бульона из одной миски в другую. Возможны разнообразные варианты генетической интеграции и трансформации, в том числе разные способы введения инородной ДНК в новую клетку. Есть методы, позволяющие выращивать ДНК в больших количествах при помощи бактериальных «пакующих клеток» и трансфекции, в основном касающиеся интеграции ДНК в эукариотические клетки. Некоторые из этих методов были разработаны в 1950-е и 1960-е гг., когда их применяли для переноса плазмид (небольших кольцевых молекул ДНК) от одних бактерий к другим (бактериальная трансфекция). Именно в то время были разработаны и первые протоколы клонирования для создания копий этих плазмид. Но, чтобы понять, как сконструировать клетку, сначала нужно научиться измерять то, что присутствует в ее геноме.
Новые методы появились в 1970-е и 1980-е гг., когда исследователи научились клонировать плазмиды и амплифицировать эти продукты при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это химическая реакция, при которой экземпляры участка молекулы ДНК постоянно удваиваются в количестве. Если в качестве мишени взять конкретную генетическую последовательность, а на ее «головном» и «хвостовом» кончиках использовать праймеры для затравки реакции, то копирование можно начать с единственного фрагмента ДНК. В результате из одного фрагмента получается два, из двух – четыре, из четырех – восемь и далее 2n. Этот простой метод, за который Кэри Муллис был удостоен Нобелевской премии, предвосхитил современную эру молекулярной биологии.
Действительно, ПЦР стала топливом, положившим начало эре «чтения геномов», когда ученые со всего мира вдохновились идеей и принялись амплифицировать ДНК всего, чего только хотели. Благодаря этим технологиям в 1995 г. Крейг Вентер получил первый бактериальный геном (гемофильная палочка), затем в 1999 г. Джеральд Рубин получил геном мушки дрозофилы. Затем последовали другие геномы. Когда есть возможность секвенировать ДНК организмов, можно начинать рассматривать на самом низком уровне, что происходит при операциях трансфекции и манипуляциях с геномом.
Известно, что, полежав на пляже в солнечный денек, одни получают красивый загар, а другие обгорают. Точно так же одни бактериальные клетки поддаются «трансформации» гораздо легче, чем другие. Преобразовать некоторые клетки не составляет труда: они с готовностью поглощают ДНК из окружающей среды. С другими процесс идет сложнее. Так, Deinococcus radiodurans известен тем, что очень быстро инкорпорирует генетический материал и сразу использует его. Еще один вид бактерий, впитывающих ДНК как губка, – кишечная палочка E. coli, давно зарекомендовавшая себя как столп современной молекулярной биологии.
Однако большинству организмов не нравится вторжение чужеродной ДНК. На клеточном уровне такое событие можно сравнить с инцидентом: вы едете в метро – и вдруг незнакомец засовывает вам в рот сосиску. Например, у растений есть встроенная жесткая клеточная стенка из целлюлозы, препятствующая проникновению внутрь клетки чужой ДНК. У эукариотических клеток (в частности, человеческих) имеются активные ферменты, именуемые ДНКазами[6]. Также в клетках предусмотрены механизмы защиты от пришлой ДНК или РНК (РНКазы), хотя они и несовершенны. Эти ферменты и физические структуры являются частью постоянной защиты от вирусов, бактерий и других инородных организмов. Помогает им активная иммунная система, которая устроена по общему принципу и у людей, и у плодовых мушек.
Поскольку человеческие клетки не склонны принимать инородную ДНК, ее приходится вводить искусственно. Этот процесс называют трансфекцией. При его осуществлении берут инфекционный агент и переносят его из одного организма в другой так, чтобы организм-хозяин принял чужую ДНК. Это можно сделать при помощи инфекционного агента, способного проникнуть в клетку, воспользовавшись молекулами, уже находящимися на поверхности клетки, или физическим процессом, который открывает клеточную мембрану.
При работе как с трансфекцией, так и с трансформацией, существует множество способов подготовки системы к приему новой ДНК. Для трансфекции понадобятся очищенные клетки, которые нужно сделать более восприимчивыми. Для этого применяются такие методы, как соосаждение с фосфатом кальция, использование липосом, электропорация (электризация клеток, в них начинают проскакивать разряды, напоминающие франкенштейновские молнии), использование генных пушек (устройств, в буквальном смысле обстреливающих клетки генами) или микроинъекций. Процесс трансформации гораздо проще, так как большинство бактерий с готовностью поглощают ДНК. Таким образом, чтобы подготовить клетки, достаточно лишь электропорации или химической трансформации.
В клетках человека наблюдаются два механизма трансфекции. При временной трансфекции новые фрагменты ДНК легко входят в клетку и легко покидают ее обычно вместе с фенотипом (признаком), который переносится таким образом. Такой метод позволяет протестировать, каково влияние экспрессии «трансгена» в течение короткого времени. Подобные преходящие изменения могут быть идеальными для терапевтических вмешательств, когда требуется обеспечить экспрессию гена лишь ненадолго, пока не будут достигнуты цели лечения, а длительная экспрессия может создавать повышенный риск для пациента. При стабильной трансфекции клеток, как понятно из названия, чужеродная ДНК на постоянной основе закрепляется в геноме клетки-хозяина. Если нужно проследить, как в длительной перспективе изменяются регуляторные процессы в клетке либо как фрагмент чужеродной ДНК влияет на развитие организма в течение всей жизни, то лучше всего воспользоваться стабильной трансфекцией. При этом генетическая «полезная нагрузка» входит в состав генома хозяина и передается потомкам, как и все прочие гены родителя. Такой подход позволяет впоследствии добавить в геном множество других элементов, чтобы оценить, как достраивание влияет на общий функционал клетки.
Однако при создании стабильно трансфицированной клеточной линии механизм внедрения чужеродной ДНК может быть сопряжен с разрушительным воздействием вируса. Для таких целей часто применяется лентивирусная инфекция или аденоассоциированный вирус. В обоих случаях требуется вирус, который заражает клетки, протаскивает в ядро свой генетический материал, а затем интегрируется в геном хозяина. Это как если бы в нетронутом лесу пустило корни нетипичное для него дерево. Однако вирус может учинить в клетке хаос, если встроится в область ДНК, расположенную вблизи от жизненно важных генов, например опухолевых супрессоров. Далее вирус еще сильнее разрушит регуляторные механизмы хозяина. Продолжая аналогию, представим, что чужеродное дерево выросло на пути небольшого ручейка и мешает ему течь. Более того, вирус может встроиться не в один, а сразу в несколько участков генома хозяина – причем эти участки будут разными в каждой генно-модифицированной клетке. Непредсказуемость таких событий может провоцировать дополнительные проблемы при «дозировке», где эффект внедренных генов является накопительным. Таким образом, стабильная трансфекция дает долгосрочные результаты и стабильный фенотип, но повышает вероятность того, что в процессе инженерии все пойдет вразнос.
Более того, не все человеческие клетки одинаковы, о чем явно свидетельствуют разные ткани в нашем организме. Это связано с изменением эпигенетической регуляции (действующей «поверх» генома). Все клетки запрограммированы на дифференциацию, поскольку человек, как многоклеточная особь, развивается из одной-единственной клетки. Эпигенетическая регуляция – это процесс, определяющий, какие из 3,1 млрд оснований, входящих в состав генома человека, являются «открытыми». Гены в каждой из человеческих клеток активируются и используются в зависимости от того, подготовлены ли они к работе. За это отвечает хроматин, белково-нуклеотидная структура, в которую «упакована» ДНК. Если хроматин открыт, то именно через эту брешь вирус может «проскочить» в клетку и встроиться в нее.
Хотя это звучит жутковато, данный процесс чрезвычайно распространен и в эволюции человека, и в жизни каждого из нас. За красноречивыми доказательствами встраивания вирусов в человеческую ДНК не надо далеко ходить – они найдутся в ваших же клетках. Если представить, что геном – 100-страничная книга с жизненно важными инструкциями, то 8 % ее записано на языке вирусов. В нашем геноме встречаются разнообразные эндогенные вирусные ДНК, что также характерно для геномов растений и животных. Транспозоны – это так называемые прыгающие гены, которые могут «копировать и вставлять» фрагменты ДНК в пределах одного и того же генома. Хотя транспозоны были открыты Барбарой Макклинток, пытавшейся объяснить пеструю окраску зерен кукурузы (впоследствии эта работа привела ее к Нобелевской премии), работа доктора Алекса Кентсиса и нашей группы также показала, что аберрантные транспозоны могут вызывать рак. Ретротранспозоны, подобно транспозонам, также перемещаются по принципу «копирования и вставки», но в качестве подложки для самокопирования и перепрыгивания они используют РНК, а не ДНК. Аналогично эндогенные ретровирусы человека – это вирусы в геноме человека, способные активироваться, превращаться из РНК в ДНК, а затем вновь интегрироваться в геном. Широко известный вирус, также встраивающийся в геном человека, – ВИЧ, но его можно считать лишь верхушкой айсберга, именуемого «генетическая маркировка».
Кроме ВИЧ есть и другие вирусы, способные встраиваться в геном и обживаться там, подобно плохому квартиранту, который устраивает в комнате беспорядок, ест ваши продукты и не платит за коммунальные услуги. Один из таких нахлебников – вирус папилломы человека (ВПЧ), некоторые штаммы которого вызывают