Клетки смогли сохранить самоуправляемость – редактирование работало! Экспрессия FMR1 поддерживалась и в отредактированных нейронах в пересаженной мозговой ткани мыши-реципиента. Однако этот процесс не удалось корректно воспроизвести у пациентов, страдающих синдромом ломкой X-хромосомы, поскольку потребовалось бы изъять, отредактировать и заменить все их нейроны. Больной вряд ли обрадовался бы такой процедуре, учитывая, что человек постоянно пользуется мозгом и, надо полагать, дорожит своими воспоминаниями. Тем не менее Йениш с коллегами показывает, что непосредственное деметилирование повторов ЦГГ в сформировавшихся (постмитотических) нейронах мозга вполне осуществимо, равно как и восстановление экспрессии FMR1. Это означает, что независимо от причин (генетических или эпигенетических) болезнь в принципе излечима.
Точно как эпигенóм управляет работой ДНК, располагаясь «поверх» генома, так и эпитранскриптóм управляет работой РНК, располагаясь «поверх» транскриптома. Разработка инструментов генетического редактирования привела к появлению нового уровня над всеми контрольными переключателями. В сущности, его можно назвать «эпи-эпиóм». Редактирование эпигенома не ограничивается метилированием цитозина. Можно редактировать даже хроматин, т. е. тот каркас, который держит ДНК. Хроматин – это гибридная структура, состоящая из белка и ДНК, которая обеспечивает сложную задачу упаковки 3 млрд оснований ДНК в небольшой пакет внутри клетки, размером всего несколько микрометров. Это удивительно – ведь если вытянуть ДНК, содержащуюся в одной клетке, то перед нами окажется двухметровая молекула. Однако такая длинная ДНК не только легко умещается в клетке, но и оставляет достаточно места для того, чтобы другие молекулы могли с ней контактировать и читать ее, как только потребуется. Все равно что взять струну, которая протянулась бы от основания до верхушки самого высокого современного небоскреба (Бурдж-Халифа, 828 м), и сложить ее в коробочку, легко умещающуюся на ладони.
Такая исключительно компактная упаковка важна не только для защиты, но и для регуляции ДНК. Регуляция осуществляется белками, составляющими хроматин, и они также, подобно ДНК, поддаются модифицированию и настройке. Один из компонентов хроматина – гистоны, как и другие белки, кодируются в ДНК в составе генома, затем транскрибируются в РНК, которую в дальнейшем рибосома транслирует в уникальный белок. Гистоны представлены в клетке как два набора димеров (H2A-H2B) и один тетрамер (H3-H4), которые затем сливаются и образуют в ядре клетки октет белков (H2A-H2A-H3-H4). Некоторые гистоны (H1 или H5) играют связующую роль, но основная часть описываемых действий разворачивается в ядре. Следовательно, в большинстве проектов, связанных с эпигенетическими исследованиями, внимание фокусируется на «гистонном коде», который регулирует работу генов и находится в H2, H3 и H4.
У клеток есть множество способов управления экспрессией генов. В частности, регулирование плотности обертывания ДНК вокруг гистонов позволяет изменять степень доступности генов. Модификация, производимая поверх гистонов, позволяет прицельно открывать и замыкать хроматин. Наряду с каталогом модификаций ДНК существует обширный массив посттрансляционных модификаций (PTM), которые могут происходить (и действительно происходят) в гистонах и других белках. Так, у гистонов H3 и H4 есть длинные вьющиеся хвостики, которые очень хорошо поддаются коррекции и модификации. Эти модификации демонстрируют, как на уровне «гистонного кода» и «эпигенетического кода» клетки управляют активностью и ролью генов и белков. Список гистонных модификаций длинный и охватывает некоторые уже знакомые нам реакции, в частности метилирование и ацетилирование, но также в этот список входят такие реакции, как фосфорилирование, цитруллинирование, сумоилирование, АДФ-рибозилирование и убиквитинирование. Как и в случае с генами, видами и многими другими биологическими модальностями, продолжают появляться все новые типы модификаций. Может наступить день, когда новые PTM или гистоны будут найдены на других планетах и мы сможем воспользоваться ими на Земле.
В принципе, гистонный код похож на колоссальный коммутатор, управляющий тем, как воздействие генов проявляется в различных типах клеток и клеточных реакциях. Возвращаясь к метафоре с коммутатором, представьте себе множество разноцветных рычажков на приборном щитке в кабине пилота, которые позволяют управлять высотой, скоростью, курсом самолета, но только в руках профессионала. Посади за такой пульт ребенка – и дело окончится катастрофой. Таким образом, работая с гистонами и эпигенетическими состояниями, необходимо очень осторожно их переключать. Ферменты, предназначенные для добавления или удаления модификаций (вспомните пилота, переключающего тумблеры), именуются соответствующим образом. Например, гистоновые метилтрансферазы переносят метиловые группы в гистоны, гистоновые ацетилтрансферазы переносят ацетиловые группы в гистоны. Кроме того, для модификаций гистонов принята собственная номенклатура, которая на самом деле довольно проста: 1) название гистона, например «H3» для гистона-3; 2) указание, где именно в концевом участке гистона производится модификация, например «K4» для 4-го лизина (это аминокислота, обозначаемая буквой «К»); 3) вид модификации, так, Me означает «метилирование», а Ac – ацетилирование и 4) количество добавляемых модификаций, например 1, 2 или 3 для моно-, ди- или триметилирования. Модифицируя конкретные сайты вдоль концевых участков гистонов, (теоретически) можно заставить клетку перейти из одного состояния или типа в другой.
Однако до 2015 г. возможность заставить ферменты работать по нашей команде оставалась фантастикой. Затем появились первые работы по модификации гистонов, выполненные Тимоти Редди и Чарльзом Гершбахом. Они представили конструкции совершенно нового вида, которые подготовили почву для работ в лаборатории Йениша – о них мы говорили выше. Редди и Гершбах сконструировали ацетилтрансферазу на основе CRISPR-Cas9, в которой опять использовался обезвреженный белок Cas9 (dCas9), но в данном случае он объединялся с активным участком человеческой ацетилтрансферазы (p300). Этот гибридный белок обеспечивает ацетилирование гистона H3 в лизине 27 (H3K27Ac) и приводит к существенной активации генов-мишеней со стороны промоторов, а также генов, расположенных далеко от сайтов-мишеней (проксимальные и дистальные энхансеры). Хотя ранее предпринимались попытки работать и с другими активаторами, основанными на dCas9, их ацетилтрансфераза могла менять экспрессию генов из энхансерных областей, используя только одну направляющую РНК для нацеливания на конкретные области-мишени.
Редди и Гершбах показали, что их система является модульной и с ее помощью можно редактировать практически любую модификацию ДНК или гистонов, как только их удается открыть путем слияния домена p300 с другими белками, которые связываются с ДНК. Экспериментируя с различными комбинациями этих модификаций, можно добиться, чтобы ген делал то, что вы хотите, когда хотите и столь долго, сколько нужно. Обладая такими инструментами, мы сами превратились в сознательный регулятор и заняли новый уровень, расположенный над геномом, транскриптомом, протеомом, эпигеномом и эпитранскриптомом. Этот уровень можно назвать «эпи-эпиом».
Возрождение вымерших видов
Идеи в сфере генной инженерии иногда приходят откуда не ждали, они рождаются даже при изучении давно вымерших видов. Хотя потенциал современных инструментов для клеточного редактирования огромен, в будущем мы, несомненно, обзаведемся еще более мощными средствами. Как обычно бывает в культуре, вдохновение дает не только изучение ныне живущих. Вполне возможно, что ответы на некоторые вопросы кроются в останках исчезнувших животных.
Каждое лето в Сибири начинается сезон охоты за так называемым белым золотом. Промысловики и копатели пускаются в тундру на поиски древних мамонтовых бивней. Такие бивни и их фрагменты продаются на рынках по всему миру, и цена иногда доходит до $1000 за килограмм. Хотя мамонты (Mammuthus primigenius) были обычными обитателями Сибири и даже пережили последнее оледенение, они не выдержали борьбы с первобытными охотниками и изменения экосистем. Последние мамонты вымерли примерно за 4000 лет до н. э.
В 2013 г. группа исследователей обнаружила почти идеально сохранившуюся тушу самки мамонта, погребенную в вечной мерзлоте в районе Якутска, Россия. Большая часть туши сохранилась в целости, в том числе три ноги, хобот и часть головы. Когда исследователи попытались извлечь ее из ледяной могилы, они впервые обнаружили сохранившуюся мамонтовую кровь – темно-красные свернувшиеся сгустки. Для генетика эта кровь ценна как золото. Радиоуглеродная датировка показала, что Лютик (так назвали находку) жила примерно 40 000 лет назад.
ДНК животного сохранилась так хорошо, что ученые, в том числе доктор Джордж Черч, наконец-то получили шанс осуществить давнюю мечту – возродить мохнатых гигантов. Что, если удастся вставить достаточное количество ДНК мамонта в современную безъядерную эмбриональную клетку индийского слона (эмбрион с удаленным ядром)? Поскольку индийский слон – ближайший современный родич мамонта, удастся ли с его помощью воскресить исчезнувший вид? А если метод сработает, то можно ли будет проделать подобное с другими видами?
Ответ утвердительный, по крайней мере если верить проекту Revive & Restore Project. На его сайте есть даже специальная страница, посвященная достижениям и планам в области воскрешения видов, в частности мамонта. Известно, что с начала XVIII в. исчезли как минимум 63 вида крупных животных, а также, надо полагать, миллионы видов микроскопических созданий, не переживших этот разрушительный период колониализма и климатических изменений. Своей целью проект ставит «сохранение био- и генетического разнообразия, восстановление оскудевших экосистем и возмещение того ущерба, который люди успели нанести природе». Уроки, извлеченные из этой работы, должны помочь нам избежать вымираний в будущем (в том числе предотвратить вымирание человека), а также изменить пред